一: 細胞培養

熒光顯微鏡對于直接用培養皿拍攝都沒有什么壓力，不過依然更建議做爬片，不僅效果更好而且更適合拍共聚焦，不想拍了也可以冷凍保存。爬片的預處理需要用多聚賴氨酸增加細胞粘附性

1，用多聚賴氨酸涂在爬片上放置30-120分鐘。

2，然后用滅菌的超純水清洗和浸泡,。

3，自然干燥了之后放在紫外下照射至少1個小時以上。爬片之前經過高溫滅菌的可以不需要這么久。

4，如果用普通蓋玻片而不是專用細胞爬片的話，一般還需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下，因為根據我的經驗，幾個牌子的普通蓋玻片都比較臟，不能直接用。

5，在培養皿內滴100uL左右的培養基，然后把爬片貼上去，這樣可以貼的很牢固也沒有氣泡。

6，常規細胞培養，如果你的細胞貼壁能力很強，比如用胰酶都要消化3min以上的，可以不需要第一步。

二：細胞固定，通透和染色

這幾個也是免疫組化的步驟，就不用解釋了。直接說流程

1，4%多聚甲醛孵育細胞10min。或者用放在-20℃預冷的甲醇孵育5min。這兩個都是常規固定液，非常規的也有甲醛，乙醇和丙酮等。

2，用提前在4℃或者冰上預冷的PBS洗三次，不要太用力。

3，抗原修復。不要驚訝，就是抗原修復。基本上很少有人會這么做，但是細胞免疫熒光里增加了抗原修復的步驟會讓抗體更容易染上，很多做不出來的抗體都可以做出來。過程就是堿性尿素緩沖液在95℃水浴10min，自然冷卻即可。

4，透化。這個步驟取決于你的抗體針對的是不是胞內蛋白，膜蛋白不需要這個步驟。常規透化劑是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分鐘然后用PBS洗干凈。

5，封閉。封閉液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物種的血清。BSA的濃度只要1%就可以，血清只要10%即可。如果你是用甲醛類做固定液，那么還需要22mg/ml的甘氨酸添加到封閉液里。如果你的一抗結合力很強或者二抗有非特異性結合，那么添加0.1%吐溫20。

6，用封閉液稀釋一抗，4℃過夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗，二抗濃度大約1抗的十倍。最后染DAPI（1ug/ml）1分鐘。

7，PBS洗三遍，用抗淬滅封片劑封片。邊緣處滴兩滴指甲油。就可以拍照了。

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