操作步驟：

（一）貼壁培養細胞

1、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為1mM。

2、去除貼壁細胞的培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的NP-40裂解液，移液器輕輕吹打，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于細胞1～3s內，細胞就會被裂解。

4、10000～12000g，4℃離心5～10min（如無低溫離心機，室溫下離心亦可），取上清。

5、后續的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（二）懸浮培養細胞

1、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

2、低速離心懸浮細胞，棄上清，收集沉淀。

3、用手指輕彈細胞，使其松散。按照6孔板每孔細胞加入150～250μl含PMSF的NP-40 裂解液。如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞，充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。

4、10000～12000g，4℃離心5～10min（如無低溫離心機，室溫下離心亦可），取上清。

5、進行后續的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（三）組織樣本

1、把組織剪切成細小的碎片，越小越好。

2、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

3、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內，以減少蛋白的降解。

4、按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液，冰上或4℃裂解30～60min。

5、步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的NP-40裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內，以減少蛋白的降解。

6、10000～12000g，4℃離心5～10min（如無低溫離心機，室溫下離心亦可），取上清。

7、進行后續的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1. 為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融。建議將其適當分裝成合適的量，然后置于-20℃保存。

2. 細胞裂解蛋白提取的所有操作步驟都需在冰上或4℃進行。

3. 建議在臨用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。PMSF可以向我公司訂購。

4. 在貼壁培養細胞的操作步驟中，去除貼壁細胞的培養液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

5. 如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。

6. 在培養細胞的裂解中，如果細胞量較多，必需分裝成50~100萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

7. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續實驗。直接裂解的優點是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設備，缺點是不如使用勻漿器或研磨那樣裂解得比較充分。

8. 如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶消化，然后再使用本裂解液進行裂解。

9. 復融后的試劑請及時使用，避免裂解液中有效成分失效。

10. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

11.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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