一、主要步驟：

①將冷凍管從液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，細胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率，復蘇過程中一般細胞死亡率在20%～25%之間。

②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然后放置在冰浴上。

③小心開啟瓶蓋，把細胞轉入含有4mL培養基的培養瓶中，然后把培養瓶移至培養箱，36℃～38℃培養1h，讓細胞貼壁。

④細胞貼壁后，小心移棄培養基，主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細胞及其碎片，加5mL新鮮培養基，36℃～38℃培養。

⑤細胞培養24h后，更換新鮮培養基，繼續培養直到形成單層，便可以傳代。

⑥詳細記錄復蘇細胞的名稱、數量、復蘇時間、存放部位等。

二、注意事項：

1、注意無菌操作。

2、應在1-2min內使凍存液完全融化。如果復溫速度太慢，則會造成細胞損傷。另外，細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。

3、細胞復蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃冰箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋。

4、細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球將凍存管消毒并晾干。

5、液氮操作有一定的危險性，打開液氮罐取出細胞時，戴上防護眼鏡。

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