1、細胞傳代

1）棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

2）用移液槍加入1ml胰酶，消化1min（37℃，5% CO2）。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。

3）加入1ml的含血清培養基終止反應。

4）用移液槍多次吹吸，使細胞完全分散開。

5）將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

6）用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8 x 106個細胞加入一個35mm培養皿。

7）將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。

8）將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。

2、細胞轉染

1）轉染試劑的準備

A、將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10s，溶解脂狀物。

B、震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩。

2）選擇合適的混合比例（1:1-1:2/脂質體體積ul：DNA質量ug）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

3）將混合液在室溫放置10-15min。

4）吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

5）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6）到時間后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養繼續培養24-48h。

3、第二次細胞傳代

1）在轉染后24h，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2）再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8 x 105個細胞/35mm培養皿將細胞重新分入培養皿中。

3）在正常條件下培養24h后，按照染色要求條件固定。

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